O processo laboratorial do PrenaTest® 

Análise do teste realizada na Alemanha de acordo com a legislação europeia

Apenas o PrenaTest® foi desenvolvido de acordo com a legislação europeia. O procedimento laboratorial em conformidade com o método de sequenciação massiva aleatória (random massively parallel sequencing (rMPS)) está descrito abaixo, bem como a sua realização no laboratório do nosso parceiro Lifecodexx em Constança, Alemanha.

1. Extração de cffDNA (cell free fetal DNA) da amostra de sangue

Primeiro, o plasma é isolado do sangue materno. Em seguida, o ADN fetal livre é extraído do plasma. O ADN livre deriva de células maternas e fetais e é extraído conjuntamente.

2. Quantificação do cffDNA

Um pré-requisito para o sucesso da análise é um nível de ADN fetal de pelo menos 4% (mínimo de 8% no caso de gestações gemelares). Primeiro, a percentagem de ADN fetal livre é calculada a partir da quantidade total. A quantificação é feita utilizando o ensaio QuantYfeX®. Se a percentagem de cffDNA for muito baixa, recomenda-se que seja posteriormente recolhida uma nova amostra de sangue para repetição do teste.

3. Sequenciação de ADN (sequenciação de nova geração)

Para poder sequenciar o ADN, os fragmentos de ADN que estão presentes em pequenas quantidades são primeiro colocados numa biblioteca genómica e amplificados. Em seguida, o ADN é sequenciado com os mais modernos equipamentos analíticos e utilizando método de sequenciação massiva aleatória. São geradas cerca de 15 milhões de sequências por amostra.

Análise bioinformática dos dados com o software PrenaTest® DAP.plus

4. Análise bioinformática dos dados com o software com marcação CE PrenaTest® DAP.plus

O objetivo é determinar se a quantidade de sequências para o cromossoma analisado excede o intervalo normal encontrado numa amostra euploide, ou seja, numa amostra normal (46,XX ou 46,XY). Os 15 milhões de sequências gerados inicialmente são classificados por comparação com o genoma humano de referência. Desta comparação obtêm-se cerca de 6 milhões de sequências que cumprem os requisitos para posterior análise. Estas sequências distinguem-se por serem únicas no genoma e 100% homólogas com o genoma de referência. A quantidade de sequências associadas a cada cromossoma é, então, determinada. (Fig. Esquerda)

 

Relacionando o número de sequências associadas a cada cromossoma à quantidade total de sequências (cerca de 6 milhões), é então calculado o  z-score . O z-score  é um valor estatístico utilizado para determinar se a amostra testada apresenta uma alteração cromossómica. Os valores limite dos z-scores  – que são utilizados para distinguir um resultado positivo de um negativo diferem para as trissomias 21, 18 e 13 devido a fatores biológicos e analíticos. Para poder determinar uma aneuploidia dos gonossomas (Síndrome de Turner, Triplo X, Klinefelter e XYY) utilizam-se critérios de avaliação adicionais e, portanto, o z-score, por si só, não  tem significado.

5. Relatório de resultados do PrenaTest®

Na etapa final, o resultado é interpretado por um profissional e documentado num relatório. Com base no resultados do Prenatest®, bem como no contexto de outras conclusões clínicas, o médico responsável poderá, portanto, excluir ou confirmar a presença de uma das anomalias cromossómicas investigadas com um elevado nível de precisão.

Cálculo de z-scores com base no teste do cromossoma 21 

 

Numa amostra com um genoma euploide é possível atribuir aproximadamente 76.000 sequências ao cromossoma 21. Comparativamente à quantidade total de 6 milhões de sequências, a percentagem destas sequências é de 1,27% (Fig. Amostra 1). Se houver Trissomia 21 fetal numa amostra testada, ou seja, uma cópia adicional do cromossoma 21, existem aproximadamente 79.000 sequências pertencentes ao cromossoma 21. Neste caso, a percentagem é de 1,32% (Fig. Amostra 2). Para calcular o z-score  de um determinado cromossoma, a percentagem é comparada com a mediana de um conjunto de amostras de referência (ou seja, um conjunto de amostras com um cariótipo euploide). Caso o desvio entre a amostra em análise e a mediana das amostras de referência seja igual ou superior a 3 há evidência de Trissomia 21. Os z-scores inferiores a 3 são normalmente encontrados em gestações normais. A distribuição dos z-scores de tais gestações corresponde à distribuição de Gauss normal. As z-scores ≥ 3 indicam a presença de Trissomia 21.

 

Cálculo do z-score do cromossoma 21

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